抗生素和耐药菌的关系，可谓是“道高一尺、魔高一丈”。近年来战况焦灼，细菌耐药性已成为全球性的公共卫生问题。看似无解的轮回战，或将由一种新疗法——噬菌体疗法的介入进行破局。
事实上，噬菌体疗法并不能说是一种新疗法，它作为抗菌剂甚至比抗生素出现的更早，之所以没有像抗生素一样大规模发展运用开来，是因为其作为抗菌剂，存在一些缺陷，包括过多未知的影响因素、操作难度大、抗菌谱太窄等问题，而合成生物学的出现，为噬菌体疗法带来了更多的可能性。
(来源：Nucleic Acids Research)
近日，中国科学院深圳先进技术研究院马迎飞团队在国际学术期刊《核酸研究》（Nucleic Acids Research，IF=19）上发表了题为“Genome-scale top-down strategy to generate viable genome-reduced phages”的文章。该工作报道了一种高通量制备底盘噬菌体的方法，在鉴定噬菌体非必需基因的同时，获得底盘噬菌体，并得到比野生型噬菌体侵染能力更强的基因组简化噬菌体，在噬菌体治疗和噬菌体合成生物学中具有巨大的潜在价值。马迎飞研究员为该文章的通讯作者，其博士生袁盛建为文章第一作者。
该研究得到了科技部重点研发计划、中科院先导 B、中科院定量工程生物学重点实验室、广东省合成基因组学重点实验室及深圳合成生物学创新研究院的资助。
▲ 图丨马迎飞（来源：受访者提供）
马迎飞于 2009 年获得中国科学院北京微生物研究所博士学位，曾先后在美国加州大学圣迭戈分校和纽约大学医学院从事人微生物组计划（Human Microbiome Project, HMP）相关项目的主要研究。2015 年入职深圳先进技术研究院。目前团队主要开展噬菌体的基础和应用研究。
高通量制备底盘噬菌体
噬菌体是地球上多样性最高和最丰富的生物体，也是合成生物学研究中重要的模式生物。底盘噬菌体通过删除基因组上的冗余基因，可以扩大噬菌体颗粒的 DNA 包装空间，搭载更多的功能基因，增强其在各种生物工程应用中的抗菌活性和潜力，同时增加对噬菌体的理解。
目前，如何高通量删除噬菌体冗余基因对科研人员来说仍然具有挑战性。第一，如何高通量识别噬菌体的非必需基因？第二，怎样筛选具有生长优势的突变噬菌体？第三，如何在逐个删除基因组不同区域这种费力且耗时的情况下，同时筛选能够维持稳健生长的突变噬菌体？
CRISPR 是细菌对抗噬菌体的防御系统，当噬菌体侵染的细菌含有人工设计的 CRISPR 系统时，就有一定概率可以删除噬菌体的某个基因（突变株 1）。如果用突变株 1 侵染含有另一个人工设计的 CRISPR 系统宿主菌时，就有一定概率可以删除噬菌体的另一个基因（突变株 2），这样持续下去，就能得到一个底盘噬菌体。
▲图丨噬菌体基因连续删除示意图（来源：受访者提供）
基于此，马迎飞团队猜想，是否可以把所有的含有不同人工设计的 CRISPR 系统宿主菌混合在一起，让噬菌体基因高通量删除并通过优胜劣汰筛选出侵染能力强的突变株？
团队开发了一种称为基于 CRISPR-Cas9 的迭代噬菌体基因组简化方法（CRISPR/Cas9-based iterative phage genome reduction, CiPGr）。针对所有目标基因，设计不同的 CRISPR 系统，并在 DNA 芯片上合成，制备出删除噬菌体不同基因的 CRISPR 细菌文库。在 CiPGr 过程中，用一群噬菌体侵染细菌文库，使不同的噬菌体删除不同的基因，形成噬菌体突变文库。如果被删除的基因对噬菌体扩增非必需，则突变噬菌体后代可以继续侵染新的细菌。噬菌体突变文库不断转接到新鲜培养的细菌文库中，使得基因缺失在噬菌体基因组中不断积累，而具有生长优势的基因组简化噬菌体将在种群中占主导地位，最终被富集并有可能被分离纯化出来。
▲图丨实验流程设计（来源：受访者提供）
团队使用 CiPGr 成功简化了四种不同的有尾噬菌体（T7、T4、seszw 和 selz）基因组，得到了它们的底盘噬菌体、非必需基因集以及比野生型侵染能力更强的基因组简化噬菌体。
对获得的噬菌体突变文库进行二代基因组测序，团队通过生物信息分析，即可操作简单、高效率的获得到噬菌体的可删除基因集。可删除基因集中的基因数量在 4 个不同噬菌体中，占总基因数的 50% 左右。
团队发现部分突变株的抑菌或杀菌能力比野生型强，并对这些突变株进行分离与鉴定。之后，研究人员将获得的噬菌体突变文库与野生型宿主菌混合在一起进行培养，证实了通过基因组简化可以获得比野生型噬菌体裂解能力更强突变株。
团队还观察到基因缺失数量随着转接次数的增加而在单克隆突变噬菌体基因组中不断积累。由此发现，单克隆突变噬菌体基因组中，越早被删除的基因，对噬菌体扩增就越不重要。即基因删除顺序与其在噬菌体扩增中的重要性顺序相关。
总的来说，该方法具有多角度的重要意义。第一，能够推广至其他野生型噬菌体，前提是需要在 CiPGr 的操作过程中获得噬菌体基因组序列，但无需其他先验的知识；第二，这些简化噬菌体能够整合更多的基因元件以增强噬菌体的功能，在噬菌体治疗中具有巨大的应用潜力；第三，噬菌体基因组中必需、非必要和准必需基因的鉴定对于噬菌体基因组的重新设计和噬菌体生物学的研究具有重大意义。
临床应用尚未发现不良效果
目前发现的很多能够杀死细菌的化合物以及一些抗生素，都对人体有不同程度的毒性。例如被誉为“最后一道防线”的抗生素多粘菌素，就对人体具有很强的肾毒性。
噬菌体发现以来，一直都有用噬菌体来治疗细菌感染成功的例子。
2019 年 nature medicine 发表了一例用噬菌体治疗超级细菌感染的案例。案例中，一个 15 岁少年在接受双侧肺移植时，感染了脓肿分枝杆菌，一种耐药性超级细菌，几乎无药可医时，医生在父母的强烈要求下，开展噬菌体治疗，利用基因组工程和正向遗传学的方法找到了三株噬菌体，成功击退了患者体内的超级细菌。
目前，国内噬菌体治疗依然处于临床试验阶段，也已有不少成功案例。
继 1958 年余㵑教授的噬菌体治疗案例 60 年后，2018 年全国第 2 例噬菌体治疗在上海市公共卫生临床中心（复旦大学附属中山医院南院）成功。该病例通过噬菌体疗法痊愈，结束了忍受多年的超级肺炎克雷伯菌尿路感染，是国内首例获得伦理审批的噬菌体治疗案例。
马迎飞还跟生辉 SynBio 透露，“我们现在正在通过大规模的动物试验来验证噬菌体疗法的效果，试验动物包括小鼠、大鼠、猴子等非常有代表性的模式生物，目前从初步结果来看，无论是对机体安全性还是机体对噬菌体的代谢，均显示它是非常安全的一种杀菌剂，没有引起动物很严重的免疫反应。”
2020 年，马迎飞团队成功联合深圳人民医院开展了深圳市第一例应用噬菌体治疗耐药鲍曼不动杆菌肺部感染的临床试验。目前为止，已经有多个人体临床应用的成功案例，经过评估之后使用噬菌体疗法进行治疗，最后成功地清除了病人肺部的耐药菌感染。
噬菌体作为新的替抗产品，有着巨大的市场需求。
“我们曾对一家三甲医院进行调研，结果显示，医院每年临床上耐药菌感染病人多达几千例，由此可估计全国范围内，新的替抗产品需求非常大，目前，往往到了耐药菌无药可医时，才想到应用噬菌体疗法，如果能够早期介入，可能会更好地改善临床上耐药菌感染的情况。”
当前噬菌体疗法，除了在临床上和养殖上的应用问题外，未来还需要临床使用标准和规范。
“目前无论是临床药物还是养殖饲料添加剂，均没有明确的临床或使用规范。希望将来我们对噬菌体进行一些创新研究之后，进一步推动监管部门的突破，促使噬菌体药物能够实现大规模应用。我个人非常看好噬菌体疗法的市场价值。”马迎飞说道。
目前，国内外在一些前沿性的噬菌体的合成生物学研究中相对比较同步，在噬菌体疗法临床及养殖上使用方面，面临着同样的一些问题。“国际上其实已经有一些公司开展噬菌体疗法的应用，如美国噬菌体领域的 APT 公司，现在已经到了临床 I 期、II 期阶段，我们属于一种紧追的状态，希望将来能够超过至少赶上它们。”
最后，马迎飞也表示非常看好合成生物学未来的发展，“我们常说 21 世纪是生物学的世纪，我觉得更准确一点地说，应该是合成生物学的世纪。对于噬菌体的合成生物学研究，能够让我们对噬菌体重新进行设计、合成，并赋予一些新的功能，让噬菌体更强大。未来，合成生物学将对噬菌体疗法应用起到巨大的推动作用。”
参考链接：1.https://academic.oup.com/nar/advance-article/doi/10.1093/nar/gkac1168/6895194